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免疫組織/細(xì)胞化學(xué) IHC/ICC 主要內(nèi)容 免疫組織化學(xué)概況 免疫組化實驗步驟和試劑 常見問題及處理方法 多色標(biāo)記 免疫組織/細(xì)胞學(xué)簡介 免疫組織學(xué) 是一種把分子水平的物質(zhì)在組織原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)進(jìn)行定性、定位測定，準(zhǔn)確具體表達(dá)出來的一種方法。這些分子水平的物質(zhì)可能與癌細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等等有關(guān) 技術(shù)平臺 免疫組織學(xué)方法分類 酶免疫組織化學(xué)染色（IHC） IHC-Fr：冰凍切片 IHC-P：石蠟切片 熒光免疫組織染色（IF） 多用于冰凍組織切片或者細(xì)胞爬片 膠體金免疫組織染色（GIHC） 根據(jù)標(biāo)本類型分類 石蠟切片：用酶免疫組織染色 冰凍切片：多用熒光免疫染色 細(xì)胞爬片：多用熒光免疫染色 免疫組化相關(guān)名稱 酶免疫組織化學(xué)（IHC）常用方法 S-P/LAB方法 基本原理 S-P/LAB方法:一個親和素和多個標(biāo)記酶（HRP）結(jié)合，多個生物素與抗體（一抗或二抗）結(jié)合，細(xì)胞的抗原（或一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，既而將酶標(biāo)記的親和素結(jié)合在生物素上，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)定位。 ABC方法 基本原理 ABC法：先按一定比例將親和素與酶標(biāo)生物素結(jié)合，形成ABC復(fù)合物，抗原先后與特異性一抗、生物素化二抗、ABC復(fù)合物結(jié)合，形成巨大復(fù)合物（網(wǎng)絡(luò)大量酶分子），最后顯色。 二抗直接偶聯(lián)酶的Polymer 基本原理 Envision兩步法：抗原與抗體反應(yīng)結(jié)合后，第二抗體上標(biāo)記有多聚化合物酶復(fù)合物（EnVision復(fù)合物），與第一抗體結(jié)合，進(jìn)而由酶作用底物進(jìn)行顯色定位。 熒光免疫組織染色方法 使用熒光標(biāo)記抗體，直接定位、定性檢測組織或細(xì)胞蛋白表達(dá)情況。較免疫組化具有靈敏度高、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)是染色組織片不能長期保存 IF常用熒光素 FITC：綠色，激發(fā)波長488nm；發(fā)射波長515nm Rhodamine：橙色，激發(fā)波長570nm；發(fā)射波長570-590nm Texas Red：紅色，激發(fā)波長589nm；發(fā)射波長570-615nm Cy3：橙色，激發(fā)波長512/550nm；發(fā)射波長570nm Cy5：紅色，激發(fā)波長625/650nm；發(fā)射波長670nm 免疫組化實驗注意事項 正確選配抗體 一抗必須是說明書上經(jīng)過驗證(tested application)可以用于IHC(IHC-P;IHC-Fr)檢測的 二抗必須是和一抗來源及亞型相配套的 正確設(shè)置合適的對照 正確選配固定方法和修復(fù)方法 正確選配顯色系統(tǒng) 免疫組化實驗對照設(shè)置 陽性對照：判斷染色全過程和所有試劑的正確性： A、內(nèi)部對照：對照組織本身明確存在的抗原（二抗系統(tǒng)的正確性） B、外部對照：明確表達(dá)待測抗原的組織或細(xì)胞（一抗的工作性） 陰性對照：明確不表達(dá)待測抗原的組織或細(xì)胞 二抗對照：不加一抗，余操作相同 免疫組化基本操作步驟及需要的試劑 免疫組化基本操作步驟 Envision二步法操作步驟 1、組織切片60℃預(yù)熱 2、常規(guī)脫蠟入水（二甲苯、各級酒精、水） 3、抗原修復(fù) 4、PBS/T洗3次，5min/次 5、3%H2O2 RT 10min（封閉內(nèi)源HRP） 6、PBS/T洗3次，5min/次 7、10%正常山羊血清RT 30min（阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-R） 8、一抗4 ℃孵育過夜 9、PBS/T洗3次，5min/次 10、二抗RT 30min 11、PBS/T洗3次，5min/次 12、DAB顯色，顯微鏡下觀察，控制顯色程度 13、充分水洗 14、蘇木素復(fù)染核 15、1%鹽酸酒精分化 16、充分水洗返藍(lán) 17、脫水、透明，中性樹膠封片 1、載玻片處理 重酪酸鉀濃硫酸浸泡24h－ddH2O漂洗—95%乙醇浸泡12h 防脫粘片劑處理： Poly-L-Lysine; AEPS; Special Reagent 可直接購買處理好的載玻片 2、組織固定 3、抗原修復(fù) 加熱修復(fù)技術(shù) 修復(fù)方法：微波加熱修復(fù)、高壓熱修復(fù)、煮沸熱修復(fù)： 常用buffer：檸檬酸Buffer:0.01M， pH6.0 EDTA buffer: pH9.0 非加熱修復(fù)技術(shù) 胃蛋白酶(細(xì)胞內(nèi)抗原): 0.4%，37℃，30mins 胰酶(細(xì)胞間抗原): 0.05-0.25%，37℃，10-15mins Proteinase K : 20ug/ml 4、封閉 正常血清(5-10%)：阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-R BSA (5%) ：阻斷組織內(nèi)源IgG、Fc-R 特殊封閉試劑：當(dāng)使用小鼠源性抗體檢測小鼠組織抗原時 內(nèi)源性生物素/親和素：有些組織如腎臟、肝臟、脾臟含有很高的內(nèi)源性生物素，如使用SP或者ABC試劑盒需要進(jìn)行封閉 封閉條件：室溫 30-120mins 如是HRP系統(tǒng)，則同時需要使用3% H2O2室溫10-30mins淬滅內(nèi)源性HRP的活性 5、一抗孵育 選擇驗證過待測種屬和實驗方法的一抗 根據(jù)說明書上推薦的固定和修復(fù)方法處理標(biāo)本 說明書推薦的稀釋比例僅作參考，需要根據(jù)標(biāo)本類型來摸索最佳稀釋比例 一般是在含1%封閉試劑的緩沖液（比如PBS(T) /TBS(T)中4℃過夜 6、二抗及酶標(biāo)記物孵育 根據(jù)一抗的來源和Ig亞型選擇合適的二抗 根據(jù)說明書推薦的稀釋比例和標(biāo)本類型摸索最佳稀釋比例 一般是在含1%封閉試劑的緩沖液（比如PBS(T) /TBS(T)中室溫(RT) 30-60mins 也可以選擇商業(yè)化的試劑盒：SP，ABC或者兩步法 7、顯色 8、復(fù)染 9、脫水/透明/封片 10、結(jié)果觀察 普通光學(xué)顯微鏡 熒光顯微鏡 IHC/ICC常見問題分析 常見問題及處理方法 組織脫片 非特異性背景染色 染色弱 無陽性染色 載玻片處理不充分 組織固定、脫水、透明不充分 組織切片太厚（>5um) 組織切片有折疊 過度的熱抗原修復(fù)（高壓、微波、水煮） 抗原修復(fù)液的pH值偏高 操作過程中沖洗方法不正確 封閉不充分：增加封閉試劑濃度、延長封閉時間 沖洗不充分：短時間多次數(shù)的洗滌更有效 實驗過程中切片干燥：試劑量充足，注意觀察，避免干片 組織切片折疊 組織抗原彌散：組織標(biāo)本及時固定，選擇合適的固定液 抗原修復(fù)不充分：更改修復(fù)方法，優(yōu)化時間 內(nèi)源性生物素/親和素：使用封閉試劑或者不用SP/ABC系統(tǒng) 二抗原因：選擇Fab段的抗體或者吸附過的抗體，設(shè)置二抗對照 一抗原因： 抗體濃度過高：降低抗體濃度、建議4℃過夜 選擇純化的抗體 設(shè)置陽性對照 試劑污染：重新配置新的緩沖液和試劑 組織固定、包埋時抗原被破壞 抗原位于細(xì)胞內(nèi)，未使用破膜劑(尤其是定位于細(xì)胞核) 抗體濃度過低，孵育時間過短 操作中滴加試劑時緩沖液未漓干，致使試劑稀釋 室內(nèi)溫度<15 ℃ 過度封閉 試劑超過有效期 抗體保存不當(dāng)導(dǎo)致活性降低 染色過程中未避光（熒光染色） 操作錯誤（漏加試劑） 組織中無抗原 固定、包埋、修復(fù)時抗原被破壞 修復(fù)方法不當(dāng) 一抗與二抗不匹配 底物和酶不匹配 封閉過度 封片劑選擇不當(dāng) 一種或多種試劑活性降低或失活 抗原位于細(xì)胞內(nèi)，未使用破膜劑 多標(biāo)記檢測 多標(biāo)記染色法 適用于同一組織片2~3個不同抗原的檢測 技術(shù)平臺： 同樣的酶，不同底物 不同的酶，不同底物 熒光檢測 適用于中性福爾馬林固定的石蠟切片、冰凍切片、細(xì)胞爬片 多色檢測操作程序 多色標(biāo)記抗體選擇 一抗最好是不同動物來源的 選擇驗證過實驗種屬和方法的抗體 根據(jù)染色順序選配合適的酶和底物 dopamine D1 receptor 免疫組化 人腎臟，石蠟切片 Human卵巢 GATA-4 核染色 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染色 骨組織 β-catenin 免疫組化2UK紅軟基地

熒光免疫技術(shù)ppt：這是熒光免疫技術(shù)ppt，包括了技術(shù)原理，實驗流程，注意事項，常見問題，時間分辨免疫熒光測定，激光共聚焦掃描顯微鏡等內(nèi)容，歡迎點(diǎn)擊下載。

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