這是基因工程菌ppt，包括了工程菌的來(lái)源和應(yīng)用，何謂基因工程，工程菌的獲得，工程菌應(yīng)具備的條件，工程菌的應(yīng)用，工程菌的培養(yǎng)，工程菌培養(yǎng)的特點(diǎn)，工程菌外漏的防范，基因工程產(chǎn)品的提取和精制等內(nèi)容，歡迎點(diǎn)擊下載。

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第十四章 基因工程菌的發(fā)酵 第一節(jié) 工程菌的來(lái)源和應(yīng)用 一、何謂基因工程 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。 基因工程的核心技術(shù)是DNA的重組技術(shù)。 重組即利用供體生物的遺傳物質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過(guò)體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來(lái)形成重組DNA分子，然后在將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀。 除DNA重組技術(shù)外，基因工程還應(yīng)包括基因的表達(dá)技術(shù)，基因的突變技術(shù)，基因的導(dǎo)入技術(shù)等。 基因工程一般分為4個(gè)步驟： 取得符合人們要求的DNA片段，這種DNA片段被稱為“目的基因”； 將目的基因與質(zhì)粒或病毒DNA連接成重組DNA； 把重組DNA引人某種細(xì)胞； 把目的基因能表達(dá)的受體細(xì)胞挑選出來(lái)。 二、工程菌的獲得 確定目的產(chǎn)物。 找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細(xì)胞。 將細(xì)胞破碎后提純出全部信使RNA。這些信使中包含了該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的合成信息。 利用基因擴(kuò)增技術(shù)（PCR），找出所需的目的基因。 將目的基因連接到設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒載體，形成了重組DNA分子。 將重組后DNA分子引入到受體細(xì)胞內(nèi)，然后選擇合適的培養(yǎng)條件使細(xì)胞繁殖。根據(jù)選擇性標(biāo)記，從菌落中篩選出目的基因的重組(工程)菌。 三、工程菌應(yīng)具備的條件 發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時(shí)是分泌型菌株。 菌株能利用常用的碳源，并可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。 菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素。 代謝控制容易進(jìn)行。 能進(jìn)行適當(dāng)?shù)腄NA重組，并且穩(wěn)定，重組的DNA不易脫落。 四、工程菌的應(yīng)用 1，基因藥物 紅細(xì)胞生成素 胰島素 干優(yōu)素 乙肝疫苗 生長(zhǎng)激素 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 2，其它發(fā)酵產(chǎn)品 酶制劑 氨基酸（蘇氨酸、色氨酸） 抗生素 第二節(jié) 工程菌的培養(yǎng) 就生產(chǎn)流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物，工程菌和常規(guī)微生物并無(wú)太多的差異。但工程菌在保存過(guò)程中及發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問(wèn)題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點(diǎn)。 一、安全問(wèn)題 關(guān)于基因工程的社會(huì)問(wèn)題，必須提到它的潛在危險(xiǎn)性。經(jīng)過(guò)重組的菌和質(zhì)粒一旦用于工業(yè)化生產(chǎn)，就不可避免地進(jìn)入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。因此，安全問(wèn)題是極其重要的。 1974年，提出了DNA重組實(shí)驗(yàn)具有潛在生物危險(xiǎn)性的問(wèn)題。后來(lái)，制定了有關(guān)DNA重組實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)則，其目的是保證實(shí)驗(yàn)的安全和推動(dòng)重組DNA的研究。 這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)安全度的評(píng)定，采用物理密封(P1~P4)和生物學(xué)密封(B1和B2)兩種方法。 物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實(shí)驗(yàn)人員和向外界擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)規(guī)模在20L以下時(shí)，物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級(jí)，數(shù)字越大，密封水平越高。 生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時(shí)用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過(guò)這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。按密封程度分B1和B2級(jí)，B2級(jí)的密封要求最嚴(yán)格。 二、工程菌培養(yǎng)的特點(diǎn) 工程菌工業(yè)化培養(yǎng)中，產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)規(guī)模為低。 為提高工程菌體表達(dá)效率，需采取適當(dāng)措施，提高重組DNA在受體細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)及促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物自細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外分泌。 工程菌體的原宿主通常是某些培養(yǎng)物質(zhì)(如某種氨基酸或維生素等)的缺陷型，有些基因工程細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程亦產(chǎn)生某些抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物。在培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)考慮控制培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分及其濃度，同時(shí)采取措施，消除抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物，以保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)。 三、工程菌的培養(yǎng) 工程菌的營(yíng)養(yǎng)控制 質(zhì)粒穩(wěn)定性 重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制及表達(dá)效率 1，底物濃度的控制 在基因工程茵培養(yǎng)過(guò)程，至少要遵循PI級(jí)物理防護(hù)的規(guī)定，因此必需進(jìn)行菌體的高密度培養(yǎng)。 從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。 2，質(zhì)粒穩(wěn)定性 （1）質(zhì)粒不穩(wěn)定的類型 分離性不穩(wěn)定：這是由于在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)粒缺失分配到子細(xì)胞中而導(dǎo)致整個(gè)質(zhì)粒丟失。 結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定：這是由于重組質(zhì)粒DNA發(fā)生缺失、插入或重排引起的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化。 （2）影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素 與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對(duì)其穩(wěn)定性的影響 宿主對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定的影響 質(zhì)�？截悢�(shù) 重組質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 （3）使質(zhì)粒穩(wěn)定的措施 組建合適載體 選擇適當(dāng)宿主 施加選擇壓力 抗生素添加法 抗生素依賴變異法 營(yíng)養(yǎng)缺陷型法 控制基因過(guò)量表達(dá) 控制培養(yǎng)條件 （4）質(zhì)粒保持率 為考察質(zhì)粒穩(wěn)定性，在此引入質(zhì)粒保持率Fn的概念，F(xiàn)n表示分批培養(yǎng)中細(xì)胞分裂n次后，培養(yǎng)液中基因工程細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值，即 假定在分批培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期每次分裂時(shí)，其質(zhì)粒丟失率為P，則Fn為 3，表達(dá)效率及質(zhì)�？截悢�(shù)控制 在工程菌培養(yǎng)過(guò)程中，表達(dá)效率與質(zhì)�？截悢�(shù)有關(guān)。在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能提高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)�？截悢�(shù)。 在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達(dá)到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細(xì)胞負(fù)荷，此時(shí)拷貝數(shù)較低，而比生長(zhǎng)速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)粒拷貝數(shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。 第三節(jié)工程菌分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué) 對(duì)于質(zhì)粒脫落性不穩(wěn)定，細(xì)胞在分裂時(shí)丟失質(zhì)粒的概率為p， 則 第四節(jié) 培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取 工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。在進(jìn)行以工業(yè)化為目的的DNA重組實(shí)驗(yàn)，以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌時(shí)，當(dāng)然應(yīng)采用簡(jiǎn)便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)�，F(xiàn)在多半使用大腸桿菌為宿主，而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長(zhǎng)良好。 一、培養(yǎng)罐 作為基因重組體的培養(yǎng)裝置，與一直沿用的通氣攪拌培養(yǎng)罐要有區(qū)別，即不僅要防止外部微生物侵入罐內(nèi)，還必須采用不使培養(yǎng)物外漏的培養(yǎng)裝置。按實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則，可把這類密閉型通氣攪拌式培養(yǎng)罐劃分為操作液量20L以上和20L以下兩種。 現(xiàn)今使用的微生物培養(yǎng)裝置，按其滅菌法又可分兩類。 一是在高壓滅菌器中進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)罐的滅菌，罐本身通常是玻璃制的，容量在10L以下的居多； 另一類是20L以上的培養(yǎng)罐，一般為不銹鋼制品，多采用通新鮮蒸氣進(jìn)行滅菌。 二、工程菌外漏的防范 首先應(yīng)了解培養(yǎng)微生物在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作。歸納起來(lái)有： 排氣， 機(jī)械密封， 接種， 取樣， 培養(yǎng)后的滅菌(通入濕熱蒸氣)， 排液(輸至下一工序)。 1，排氣 2，機(jī)械密封 考慮培養(yǎng)液外漏的情況，培養(yǎng)基因工程菌時(shí)，以用上部攪拌的雙機(jī)械密封為好。 3，取樣 普通培養(yǎng)罐的取樣管道在取樣時(shí)會(huì)流出樣品。取樣后對(duì)樣品管道滅菌時(shí)，未滅菌的培養(yǎng)液污水被排至排水管內(nèi)。對(duì)此，必須采取措施，如用取樣工具進(jìn)行取樣。此法可在培養(yǎng)液不接觸外界的條件下取樣。 4，培養(yǎng)后的滅菌 培養(yǎng)后對(duì)培養(yǎng)液和管道等進(jìn)行滅菌時(shí)，一開(kāi)始流出的末滅菌排水有可能存在活的重組菌。取樣、排液的管道中能產(chǎn)生這類排水，因此，一定要另行安裝排水管并與廢液滅菌貯槽等相連接，以便排放污水。 5，接種 向罐內(nèi)直接接種的方法是不安全的。簡(jiǎn)單的安全接種法是將種子瓶與培養(yǎng)罐以管相連接后，用無(wú)菌空氣加壓壓入的方法。另一種方法是先把種子液在安全柜內(nèi)移至供接種用的小罐內(nèi)，再將其與培養(yǎng)罐連接，用蒸汽對(duì)連接部分滅菌后，把種子罐中的種子液接入培養(yǎng)罐內(nèi)。 6，排液 培養(yǎng)后要將培養(yǎng)液輸送至貯罐等下一道工序，這時(shí)也有可能產(chǎn)生氣溶膠和重組菌的擴(kuò)散。安全的方法是在培養(yǎng)開(kāi)始前就將排液口與下段工序相連接并進(jìn)行滅菌，這樣培養(yǎng)一結(jié)束即可直接輸送培養(yǎng)液。如果排液口未與下段工序相連那就應(yīng)與連結(jié)廢液滅菌罐的排水管道相接，這樣就安全了。 三、培養(yǎng)罐的管道布局 下圖表示重組菌培養(yǎng)罐(P2、P3級(jí))的整體流程圖。重組菌培養(yǎng)罐中，凡有可能外漏重組菌的部分都與排污管道相連。圖中所示的管路能分離并排出污染重組菌的污水。 四、基因工程產(chǎn)品的提取和精制 傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的不同，主要表現(xiàn)在下列兩方面： 傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品多為小分子(工業(yè)用酶除外，但它們對(duì)純度要求不高，提取方法較簡(jiǎn)單)，其理化性能，如平衡關(guān)系等數(shù)據(jù)都已知，因此放大比較有根據(jù)；相反，基因工程產(chǎn)品都是大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)。 基因工程產(chǎn)品大多處于細(xì)胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，增添了很多困難。 另外，對(duì)于基因工程產(chǎn)品，還應(yīng)注意生物安全(biosafety)問(wèn)題，即要防止菌體擴(kuò)散，特別對(duì)前面幾步操作，一般要求在密封的環(huán)境下操作。例如用密封操作的離心機(jī)進(jìn)行菌體分離時(shí)，整個(gè)機(jī)器處在密閉狀態(tài)，在排氣口裝有一無(wú)菌過(guò)濾器，同時(shí)有一根空氣回路以幫助平衡在排放固體時(shí)系統(tǒng)的壓力，無(wú)菌過(guò)濾器用來(lái)排放過(guò)量的氣體和空氣，但不會(huì)使微生物排放到系統(tǒng)外。OSr紅軟基地

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