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一、實驗?zāi)康? 掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法 二、實驗原理 分離質(zhì)粒DNA方法 堿變性法 煮沸法 SDS法 羥基磷灰石層析法等 各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟且收得率較高，提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切，連接與轉(zhuǎn)化 堿變性法基本原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài) 將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA 三、實驗材料 實驗試劑 ＬＢ培養(yǎng)基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH7.5 NaCl 10g ＳＴＥ： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA ＡｍＰ 50mg/ml 溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鮮配制） 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 溶液Ⅱ：（新鮮配制） 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 酚，氯仿，乙醇 RNase 瓊脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA 四、實驗方法 １．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5ml LB培養(yǎng)液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃強烈搖蕩過度 ２．取1.5ml培養(yǎng)液至Eppendorf管中，12000g離心30秒，棄上清，用１ml STE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清，取沉淀 ３．將細菌沉淀懸浮于100μl預(yù)冷溶液Ⅰ中，振蕩混勻，冰上放置5分鐘 四、實驗方法 ４．加入200μl溶液Ⅱ，蓋嚴(yán)管蓋輕柔顛倒以混勻內(nèi)容物，冰上放置5分鐘 ５．加入150μl溶液Ⅲ，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置５分鐘 ６．12000g 4 ℃離心５分鐘，取上清移到１個新的Eppendorf管中 ７．加入等體積酚/氯仿（１：１），振蕩混勻，12000g 4 ℃離心２分鐘。取上清移至另１個Eppendorf管中 ８．加入２倍體積無水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置2分鐘。 ９．12000g ，4 ℃離心５分鐘。 10．棄上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴(yán)管蓋顛倒數(shù)次，12000g 4 ℃離心２分鐘。 11．棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（5-15分鐘）。 12．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。 13．取10μl DNA溶解液用ＴＥ稀釋至1000ul測定OD260和OD280，計算OD260/OD2 80之比 14.同時以以下公式計算得率 質(zhì)粒DNA得率： 稀釋倍數(shù)×OD260×0.05×50/1.5ml 15．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%瓊脂糖，電泳3小時，電壓40伏。 16．電泳凝膠在透射式紫外檢測儀上觀察，記錄結(jié)果 五、實驗結(jié)果分析 １．根據(jù)質(zhì)粒DNA OD260，OD280值，計算質(zhì)粒DNA得率和DNA純度 ２．記錄電泳結(jié)果并說明結(jié)果內(nèi)容 六、思考題 １．簡要敘述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及實驗中 分別加入上述溶液后，反應(yīng)體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因 ２．簡要敘述酚氯仿抽提ＤＮＡ體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因 實驗二  實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法 實驗原理 感受態(tài)：細菌能夠吸收外源DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài) 細菌經(jīng)低滲氯化鈣處理后，細胞膨脹、細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過細胞的狀態(tài) 本實驗以 E.coli DH5α 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài) 實驗儀器 實驗試劑   大腸桿菌DH5α   LB培養(yǎng)基，   0.1mol/LCaCl2溶液（預(yù)冷） 實驗步驟 菌株活化 感受態(tài)細胞制備 實驗步驟 菌株活化 1．用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37℃培養(yǎng)16小時 2．挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到3－5mlLB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時 3．將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時，到OD600＝0.3－0.4 感受態(tài)細胞制備 4．將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，在冰上放置15－30min 5．6000rpm離心10min，棄上清 6．加入0.3ml預(yù)冷的0.1mol/l CaCl2，懸浮沉淀，冰上預(yù)冷10min 7．4000rpm離心5 min，棄上清 8．加入0.2ml預(yù)冷含有甘油的0.1mol/l CaCl2，懸浮沉淀，即為感受態(tài)細胞，可－70℃長期保存 實驗三  實驗?zāi)康?1.了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義 2.學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入受體菌細胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法 轉(zhuǎn)化 將外源 DNA 分子引入受體細胞，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術(shù) 常用轉(zhuǎn)化方法 電擊法 CaCl2、RuCl等化學(xué)試劑法 實驗原理 本實驗以 E.coli DH5α 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài)，加入 pUC18質(zhì)粒，在鈣離子的作用下，質(zhì)粒與鈣離子形成復(fù)合物吸附在細菌細胞表面，經(jīng)42℃短暫熱刺激，細胞膜通透性增大，可吸收吸附的質(zhì)粒DNA，即實現(xiàn)轉(zhuǎn)化 實驗原理 pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，接受該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性。將轉(zhuǎn)化后的受體細胞于含氨芐青霉素平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡 影響轉(zhuǎn)化率的因素 細胞生長狀態(tài)和密度 轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA質(zhì)量、濃度 試劑的質(zhì)量 防止雜菌和其它外源DNA污染 實驗儀器 實驗試劑   感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α   LB培養(yǎng)基，   0.1mol/LCaCl2溶液（預(yù)冷）   氨芐青霉素 pUC18質(zhì)粒 實驗步驟 1. 取目的DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，于冰上放置30min 2. 于42℃水浴90S 3. 冰上放置2min 4. 加入1ml LB液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)1小時 實驗步驟 5. 3000rpm離心2min 6. 吸出上清液0.8ml，將剩余液體輕輕吸打、混合均勻 7. 將培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上 8. 將平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14個小時，然后觀察結(jié)果 對照組 轉(zhuǎn)化率 思考題 分子生物學(xué)中常用的載體有哪些 實驗步驟第4步加入1ml LB液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)1小時的作用是什么 實驗四 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 實驗?zāi)康?通過本實驗學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)基本原理與實驗技術(shù) 實驗原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。 在待擴增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。 PCR技術(shù)原理 1.變性：在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性 2.退火：是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補的一小段DNA片段 3.延伸：從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈 實驗儀器 實驗材料 1、DNA模板 2、4種dNTP 3、引物1、引物2 4、Taq酶 5、瓊脂糖 6、DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物 7、吸頭、50ul PCR管 試劑 10×PCR緩沖液(含Mg2＋) 4×dNTP (每種1mmol) Tag酶 1U/ul DNA模板 引物1: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3` 引物2: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3` 引物溶液濃度 10pmol/ul 實驗步驟 在0.5ml RCR管內(nèi)配置20ul反應(yīng)體系： PCR反應(yīng)程序 (1) 94℃變性5min， (2) 94℃變性1min， (3) 52 ℃退火1min， (4) 72 ℃延伸1min。 (5) 重復(fù)(2)-(4)30次 （6）72 ℃延伸1min。 實驗結(jié)果XNr紅軟基地

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