這是一個(gè)關(guān)于多糖類藥物市場(chǎng)前景PPT，關(guān)于多糖類藥物的分析，包括了概述，多糖的純度測(cè)定，多糖分子量測(cè)定，多糖的含量測(cè)定，多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析等內(nèi)容，多糖類藥物的分析一、概述二、多糖的純度測(cè)定三、多糖分子量測(cè)定四、多糖的含量測(cè)定五、多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析第一節(jié) 概述 1．從動(dòng)物來(lái)源的多糖。 2．從微生物來(lái)源的多糖。 3．從植物來(lái)源的多糖。 4. 從海洋生物來(lái)源的多糖。 組成分類：均一多糖不均一多糖:不同類型的單糖縮合而成粘多糖：含氮的不均一多糖結(jié)合糖：肽聚糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋白聚糖 糖蛋白通過(guò)糖肽鍵(carbohydrate-peptide linkage) 將糖鏈和肽鏈兩部分連接起來(lái),連接方式主要分為β-構(gòu)型的N-糖苷鍵和α-構(gòu)型的O-糖苷鍵. 糖蛋白有三種主要類型糖蛋白分為三種主要類型：O-糖苷鍵型糖蛋白、N-糖苷鍵型糖蛋白和連有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。在大多數(shù)的O-糖苷鍵型糖蛋白中，GalNAc殘基通過(guò)O-糖苷鍵與一個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基連接形成，縮寫為GalNAc-Ser/Thr。 在N-糖苷鍵型糖蛋白中，GlcNAc殘基通過(guò)N-糖苷鍵與一個(gè)天冬酰胺殘基相連，縮寫為GlcNAc-Asn。O- （N-）糖苷鍵型糖蛋白磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白蛋白聚糖 軟骨蛋白聚糖:聚集體的分子量非常大（大約為2×108），其中含有透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素、連接蛋白、核心蛋白和大量的寡糖鏈，歡迎點(diǎn)擊下載多糖類藥物市場(chǎng)前景PPT。

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多糖類藥物的分析一、概述二、多糖的純度測(cè)定三、多糖分子量測(cè)定四、多糖的含量測(cè)定五、多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析第一節(jié) 概述 1．從動(dòng)物來(lái)源的多糖。 2．從微生物來(lái)源的多糖。 3．從植物來(lái)源的多糖。 4. 從海洋生物來(lái)源的多糖。 組成分類：均一多糖不均一多糖:不同類型的單糖縮合而成粘多糖：含氮的不均一多糖結(jié)合糖：肽聚糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋白聚糖 糖蛋白通過(guò)糖肽鍵(carbohydrate-peptide linkage) 將糖鏈和肽鏈兩部分連接起來(lái)，連接方式主要分為β-構(gòu)型的N-糖苷鍵和α-構(gòu)型的O-糖苷鍵. 糖蛋白有三種主要類型糖蛋白分為三種主要類型：O-糖苷鍵型糖蛋白、N-糖苷鍵型糖蛋白和連有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。 在大多數(shù)的O-糖苷鍵型糖蛋白中，GalNAc殘基通過(guò)O-糖苷鍵與一個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基連接形成，縮寫為GalNAc-Ser/Thr。 在N-糖苷鍵型糖蛋白中，GlcNAc殘基通過(guò)N-糖苷鍵與一個(gè)天冬酰胺殘基相連，縮寫為GlcNAc-Asn。 O- （N-）糖苷鍵型糖蛋白磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白蛋白聚糖 軟骨蛋白聚糖:聚集體的分子量非常大（大約為2×108），其中含有透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素、連接蛋白、核心蛋白和大量的寡糖鏈。多糖組成-單糖葡萄糖環(huán)狀結(jié)構(gòu)椅式構(gòu)象 直鏈淀粉是葡萄糖以α-1，4糖苷鍵結(jié)合成的鏈狀化合物 纖維素多糖的理化性質(zhì)旋光性 硫酸蒽酮反應(yīng)（620nm）硫酸苯酚反應(yīng)(490nm) 氨基己糖——乙酰丙酮(525nm) 糖醛酸——硫酸咔唑(520nm) 第二節(jié) 多糖的純度測(cè)定 （一）超離心法（二）電泳法（三）凝膠色譜法（四）旋光法 第三節(jié) 多糖的分子量測(cè)定 凝膠色譜法粘度法超離心法高效液相色譜凝膠層析法凝膠層析法：將分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離。最先淋出的是最大的分子。 Kd = 0， Ve= V0 ； Kd = 1 ， Ve= V0+Vi ； 0＜Kd＜1，Ve=V0+KdVi 。凝膠色譜法方法： Sephadex G-200，多糖標(biāo)準(zhǔn)品分部收集，硫酸-苯酚檢測(cè)，分別求得洗脫體積Ve， Ve與 1gM之間存在著線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 Ve=-KlogM+C 將待測(cè)樣品上柱，待測(cè)多糖Ve。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)多糖分子量。粘度法、超離心法粘度法：用已知結(jié)構(gòu)相似的多糖決定K值（ η ＝ K M2），然后測(cè)出待測(cè)多糖的特性粘數(shù)η ，計(jì)算待測(cè)多糖的分子量。 超離心法：根據(jù)測(cè)得的沉降系數(shù)計(jì)算多糖的平均分子量。 高效液相色譜法測(cè)定分子量及分布 色譜條件： 凝膠柱（分子量大�。�，示差折光檢測(cè)器。　　　　標(biāo)準(zhǔn)曲線： 標(biāo)準(zhǔn)曲線：LogMW = a+b tR MW為重均分子量，tR為保留時(shí)間待測(cè)多糖分子量（GPC專用軟件）：　 重均分子量 Mw=∑(RIiMi)/∑ RIi Mi為供試品在保留時(shí)間ti 時(shí)的分子量，RIi在第i部分中被洗脫物質(zhì)的量（重量）。 第四節(jié)、多糖的含量測(cè)定比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物測(cè)定法（肝素鈉） 生色底物法（低分子量肝素鈉）乙酰丙酮法（elson-morgan） ——氨基己糖原理：氨基己糖在堿性條件下加熱，可與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，該衍生物與對(duì)－二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，反應(yīng)物呈紅色，于525nm測(cè)定吸收度。 硫酸咔唑法測(cè)糖含量硫酸咔唑法—己糖醛酸測(cè)定 在濃硫酸中，己糖醛酸與咔唑溶液反應(yīng)生成的反應(yīng)物呈紅色。 520nm比色 硫酸苯酚法測(cè)定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，該單糖在強(qiáng)酸性條件下，與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物。 它在490nm處有最大吸收，其吸光度與濃度呈線性關(guān)系。蒽酮法測(cè)定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸中水解后，進(jìn)一步脫水生產(chǎn)糠醛類衍生物，與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物，620nm進(jìn)行比色測(cè)定。 特點(diǎn)：10-100μg范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖含量成正比。靈敏度高。生物測(cè)定法－肝素測(cè)定美國(guó)藥典采用羊血漿法。 即比較肝素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品延長(zhǎng)血漿凝結(jié)時(shí)間的作用來(lái)測(cè)定肝素的效價(jià)。生物測(cè)定法——肝素測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制:精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按高、中、低劑量組（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0.9%氯化鈉溶液配成三種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值為1:0.7。 供試品稀釋液的配制：按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)（AT），照標(biāo)準(zhǔn)品溶液與稀釋液的配制法配成高、中、低（ dT1 、dT2、 dT3 ）三種濃度的稀釋液。 各管凝結(jié)時(shí)間換算成對(duì)數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的量反應(yīng)平行線測(cè)定法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差�？尚畔蘼剩‵L%）不得大于5%。生色底物法原理－肝素、低分子肝素 生色底物 Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰；對(duì)-硝基苯胺（pNA）。酰胺分解法（amidolytic method）。當(dāng)?shù)鞍酌笍纳�色底物分裂出pNA時(shí)，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與肝素效價(jià)成反比。 。 405 nm測(cè)定。生色底物法 抗Xa因子活性測(cè)定 以溶液吸收度和濃度的對(duì)數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線測(cè)定法計(jì)算出供試品的抗Xa因子活性 可信限率(FL%)不得大于10%。 第五節(jié)、多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析單糖組成糖苷鍵連接方式糖苷鍵連接位置 （一）多糖組成單糖的分析 1、水解方法（1）、完全酸水解法（2）、部分酸水解、堿水解（3）、乙酰解（4）、甲醇解（5）、酶降解 2、鑒定（1）、完全酸水解法 水解難易取決單糖性質(zhì)及構(gòu)型。呋喃型戊聚糖較吡喃型己聚糖易水解，α型較β型易水解。 已聚糖一般用1 mol/L硫酸，70℃，8小時(shí)。氨基葡聚糖為4 mol/L鹽酸，100℃ 9小時(shí)。 （2）、部分酸水解、堿水解選擇溫和的條件水解多糖，使糖鏈中某種類型的鍵特異性地打斷。 （3）、乙酰解多糖經(jīng)過(guò)乙酰解反應(yīng)（醋酐、冰醋酸）可生成乙酰化單糖和寡糖（4）、甲醇解多糖鏈在80－100℃條件下與無(wú)水甲醇反應(yīng)能將糖鏈變成組成單糖的甲基糖苷。 甲基糖苷能轉(zhuǎn)化為三甲基硅醚衍生物或乙�；�衍生物，進(jìn)行氣相色譜分析。（5）、酶降解分為外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶。 外切糖苷酶：切下多糖非還原末端的一個(gè)單糖，并對(duì)單糖組成和糖苷鍵有專一性要求。內(nèi)切糖苷酶可水解糖鏈內(nèi)部的糖苷鍵，釋放多糖鏈片斷以利于結(jié)構(gòu)分析。 2、單糖的分離鑒定氣相色譜法 常用的衍生物有： 三甲硅烷（TMS）衍生物 三氟乙酰（TEA）衍生物 乙酰（AC）衍生物 甲基（Me）衍生物二、糖苷鍵連接方式的測(cè)定紅外光譜——糖苷鍵類型確定吡喃糖糖苷鍵時(shí)，用紅外光譜，在890cm-1處有特征吸收者，示有β-型糖苷鍵，在840cm-1處有特征吸收者，示有α-型糖苷鍵。 核磁共振譜——糖苷鍵（α型或β型）。 H-NMR譜中的化學(xué)位移δ5.4 和δ 5.1 ，有兩個(gè)信號(hào)說(shuō)明分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵為α型，如有δ 4.53說(shuō)明有β型。三、糖苷鍵連接位置的測(cè)定（一）、高碘酸氧化、Smith降解（二）、甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析（三）、乙酰解后質(zhì)譜分析（一）高碘酸氧化、Smith降解原理：選擇性的氧化降解反應(yīng)，能夠作用于多糖分子中1，2—二羥基和1，2，3—三羥基，生成過(guò)碘酸氧化產(chǎn)物；此產(chǎn)物用硼氫化鈉還原后，再用酸水解，生成相應(yīng)的醛、甲酸。 室溫下用稀無(wú)機(jī)酸水解還原產(chǎn)物。 1，2連接的糖苷鍵 1，2連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及甘油醛。 方程式： 1，3連接的糖苷鍵 1，3連接的糖苷鍵與高碘酸不起反應(yīng)，經(jīng)還原與水解后得到原來(lái)的單糖。 方程式： 1，4連接的糖苷鍵 1，4連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原，用稀鹽酸水解得到最終產(chǎn)物為赤蘚醇和乙醇醛。 1，6連接的糖苷鍵 1，6連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及乙醇醛。（二）甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析原理：多糖經(jīng)甲基化試劑作用使分子中的羥基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以氣相色譜鑒定甲基化水解產(chǎn)物。 如多糖分子中帶有支鏈，甲基化水解后可生成二甲基單糖。（三）乙�；�后質(zhì)譜分析原理：多糖經(jīng)過(guò)乙�；�反應(yīng)（醋酐、冰醋酸）生成乙�；瘑翁呛凸烟�。 用氯仿抽提，蒸去氯仿，進(jìn)行質(zhì)譜分析。 分子離子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰單糖碎片峰，表明有支鏈結(jié)構(gòu)。實(shí)例：右旋糖酐（dextran）右旋糖酐，又稱葡聚糖，是若干個(gè)葡萄糖脫水形成的聚合物。微生物多糖，也是第一個(gè)工業(yè)化的微生物多糖，是由腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）發(fā)酵產(chǎn)生的。產(chǎn)物的分子量很大，經(jīng)水解后，用不同濃度乙醇多定分級(jí)沉淀，得到中、低、小分子量的右旋糖酐成品。 臨床上使用的是平均分子量為16000~24000，32000~42000和64000~76000的右旋糖酐20、右旋糖酐40和右旋糖酐70，它們均是用做代血漿。一、結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)右旋糖酐的結(jié)構(gòu)：它主要由葡萄糖（1→6）α-糖苷鍵連接而成，同時(shí)含有(1→3)α-和(1→4)α-糖苷鍵連接形成的分支結(jié)構(gòu)。右旋糖酐為白色無(wú)定形粉末，無(wú)臭、無(wú)味，易溶于熱水。 右旋糖酐溶于水后形成有一定粘度的膠體溶液，在乙醇等有機(jī)溶劑中不溶。二、鑒別右旋糖酐經(jīng)堿性水解后產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖可使Cu2+還原為紅色氧化亞銅沉淀。 操作方法：取本品0.2 g，加水5 ml溶解后，加氫氧化鈉試液2 ml與硫酸銅試液數(shù)滴，加熱后變成紅棕色沉淀 。三、檢查右旋糖酐的檢查項(xiàng)目較多，其中氯化物、重金屬、干燥失重、熾灼殘?jiān)�的檢查參見中國(guó)藥典2000年版二部附錄，此外還有氮、分子量與分子量分布的檢查。 氮:用發(fā)酵法制備右旋糖酐時(shí)，發(fā)酵濾液中存在著微量蛋白質(zhì)。氮取本品0.2 g，置50 ml凱氏燒瓶中，加硫酸1 ml，加熱消化至供試品成黑色油狀物，放冷，加30%過(guò)氧化氫溶液2 ml，加熱消化至溶液澄清，冷卻至20℃以下，加水10 ml，滴加管中，再用水稀釋至刻度，緩緩加堿性碘化汞鉀試液2 ml，隨加隨搖勻；如顯色，與標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(每1 ml相當(dāng)于10 μg的N)1.4 ml加硫酸0.5 ml用同一方法處理后顏色比較，不得更深(0.007%)。 分子量與分子量分布右旋糖酐20： 3500 —— 7萬(wàn)右旋糖酐40： 5000 ——12萬(wàn)右旋糖酐70： 15000 ——18.5萬(wàn) 四、含量測(cè)定旋光光度法，根據(jù)右旋糖酐水溶液的旋光度在一定范圍內(nèi)與濃度成正比來(lái)測(cè)定含量。 以右旋糖酐40氯化鈉注射液的含量測(cè)定為例。 取本品10 ml，置50 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，照旋光度測(cè)定法測(cè)定，按下式計(jì)算右旋糖酐的含量C=0.5128α C為每100 ml注射液中含有右旋糖酐的重量； α為測(cè)得的旋光度×稀釋倍數(shù)。第三節(jié) 多糖的分子量測(cè)定 凝膠色譜法粘度法超離心法高效液相色譜——重均分子量四、多糖的含量測(cè)定比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物測(cè)定法（肝素鈉） 生色底物法（抗FⅩa 活性）第五節(jié)、多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析單糖組成糖苷鍵連接方式糖苷鍵連接位置——高碘酸氧化、Smith降解Wrd紅軟基地