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臨床微生物學(xué)概論（第一部分） 主要內(nèi)容 標(biāo)本采集 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 正常菌群 在正常人體體表與外界相通的腔道：口腔、鼻咽腔、腸道、泌尿生殖道存在的多種微生物。 在機(jī)體免疫功能正常時(shí)對(duì)人體有益無(wú)害，屬人類正常微生物群或環(huán)境中通常不致病的微生物，因以細(xì)菌和真菌為主，故稱“正常菌群”。 正常菌群的存在是保持人體健康的重要因素 反映出在正常情況下，宿主、正常菌群和外界環(huán)境相互適應(yīng)，保持平衡狀態(tài)。 病原微生物 病原微生物(pathogen)： 引起人類感染性疾病的微生物稱為病原微生物或致病微生物。 細(xì)菌：如痢疾志賀菌、腸桿菌科細(xì)菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌屬等 病毒：如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、乙型肝炎病毒等 真菌：如念珠菌屬、曲霉屬、毛霉屬以及新型隱球菌等 其他：如支原體、衣原體、螺旋體 臨床常見的病原微生物 革蘭陽(yáng)性菌： 葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌 革蘭陰性菌： 需氧球菌： 腦膜炎和淋病奈瑟球菌、卡他莫拉菌 需氧桿菌： 不動(dòng)桿菌、假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、嗜血桿菌 需氧和兼性厭氧：腸桿菌科細(xì)菌如大腸桿菌、肺桿、傷寒、志賀菌。 厭氧細(xì)菌：脆弱擬桿菌、痤瘡丙酸桿菌等 苛 養(yǎng) 菌 定義：是一類生長(zhǎng)需要特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)菌，與許多感染性疾病有關(guān)，其分離培養(yǎng)較為困難。 營(yíng)養(yǎng)要求高 肺炎鏈球菌：培養(yǎng)基內(nèi)要加入血或血清 流感嗜血桿菌：X、V因子 比較嬌嫩、對(duì)干燥、對(duì)寒冷的抵抗力均較弱。 培養(yǎng)條件：5～10％CO2、35℃培養(yǎng)、24～ 48h 呼吸道其他快生長(zhǎng)細(xì)菌的覆蓋使分離率非常低 厭 氧 菌 是一群專性厭氧，必須在無(wú)氧環(huán)境下才能生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌。 根據(jù)能否形成芽胞，可將厭氧菌分成兩大類。 厭氧芽胞梭菌屬 無(wú)芽胞厭氧菌 厭氧芽胞梭菌屬：破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、肉毒梭菌、艱難梭菌 無(wú)芽胞厭氧菌：擬桿菌屬、梭桿菌屬、丙酸桿菌屬、消化鏈球菌屬等 標(biāo)本的采集 抗菌藥使用前 正確的部位 正確的時(shí)間 足夠的數(shù)量 無(wú)菌的容器 特殊要求應(yīng)在化驗(yàn)單上注明 主要的臨床標(biāo)本種類 標(biāo)本類型 呼吸道標(biāo)本 深部咳出痰、支氣管灌洗液 咽拭子、鼻氣管吸出液、氣管吸出液 尿液 血液 腦脊液 傷口、膿液 其它體液 胸水、心包液、引流液、腹水、滑囊液 標(biāo)本的處理 涂片光鏡檢查 診斷病原最基本和快速的方法：腦脊液 直接形態(tài)學(xué)檢查 革蘭染色或特殊染色 分離培養(yǎng)和鑒定 動(dòng)物接種 免疫學(xué)檢查 革蘭染色評(píng)估呼吸道標(biāo)本是否合格？ 痰標(biāo)本>10鱗狀上皮細(xì)胞/每低倍視野=拒收 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)接種于培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件： 35℃ 24-48小時(shí)或 5%-10% CO2 35 ℃ 24 - 48小時(shí) 厭氧培養(yǎng) 具有特殊性狀的細(xì)菌 具有特殊性狀的細(xì)菌 細(xì)菌的鑒定 表型分類法 以細(xì)菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理、生化和血清學(xué)反應(yīng)等細(xì)菌的表型為主要依據(jù) 分子生物學(xué)技術(shù) 基因診斷依據(jù)分析DNA的堿基組成，基因片段的大小，與比較DNA的同源性關(guān)系，從而分析 細(xì)菌DNA的親緣關(guān)系。 流感嗜血桿菌的衛(wèi)星現(xiàn)象 菌種鑒定—鑒定到種 根據(jù)純分細(xì)菌的形態(tài)、菌落特征，特征性的生化反應(yīng)，選擇合適的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。 如手工的API條和半自動(dòng)的ATB 腸桿菌科細(xì)菌：API 20E 非發(fā)酵革蘭陰性桿菌：API 20NE 葡萄球菌屬：Slidex Staph Plus、API Staph 鏈球菌屬：Slidex Strepto Kit、API Strep 奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬：API NH 厭氧菌：API 20A 菌種鑒定—鑒定到種 自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏儀 VITEK 2 Compact BD Phoenix System MicroScan BIOMIC V3微生物鑒定系統(tǒng) BIOFOSUN微生物鑒定系統(tǒng) 鑒定到種 葡萄球菌？ 金黃色葡萄球菌！ 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)快速化是未來(lái)的趨勢(shì) 質(zhì)譜檢測(cè)黏菌素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌 抗菌藥物和藥敏試驗(yàn) 抗菌藥物是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學(xué)合成藥物。前者是真菌、放線菌、細(xì)菌等的代謝產(chǎn)物，后者是經(jīng)化學(xué)改造的半合成抗生素和化學(xué)合成藥物。 測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑菌或殺菌作用的方法稱為藥物敏感性試驗(yàn)（Antimicrobial Susceptibility Testing， AST），簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)。 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的意義 無(wú)法推測(cè)敏感或耐藥 病人個(gè)體化治療指南 提供經(jīng)驗(yàn)治療的依據(jù) 建立當(dāng)?shù)鼗驀?guó)家處方政策 監(jiān)測(cè)流行病學(xué)趨勢(shì) 監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性 測(cè)試新抗菌藥物的抗菌活性 檢測(cè)新耐藥機(jī)制的方法 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)分類 定量方法 (MIC， mg/L) 瓊脂稀釋法 肉湯稀釋法 E-test 定性方法 (SIR) 紙片擴(kuò)散法 自動(dòng)化儀器 稀釋法的定義 以一定濃度的抗菌藥與含有被試菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列對(duì)倍數(shù)稀釋，經(jīng)培養(yǎng)后肉眼觀察未見細(xì)菌生長(zhǎng)管內(nèi)所含的最低藥物濃度為該藥對(duì)該試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration， MIC) 稀釋法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以精確測(cè)得藥物最低抑菌濃度，但需耗費(fèi)較多材料、人力和時(shí)間。 稀釋法的分類 稀釋法藥敏試驗(yàn)因介質(zhì)不同可分為液體稀釋法和瓊脂稀釋法。 因容器不同分為試管稀釋法和微量稀釋法，或稱常量法和微量。 前者使用無(wú)菌的13mm×100 mm試管，每一濃度抗菌藥的量至少為1ml； 后者使用8×12的U型底小孔的微量稀釋板，小孔內(nèi)裝有0.1ml肉湯。 瓊脂稀釋法又因在平皿中進(jìn)行而稱為平皿稀釋法。 微量稀釋法的優(yōu)點(diǎn)為試劑材料較節(jié)省，而且微量板中可預(yù)先配制好抗菌藥和培養(yǎng)基，冷藏后一定時(shí)期內(nèi)使用，較為方便。 與試管稀釋法相比，瓊脂稀釋法配合多點(diǎn)接種器使用，可同時(shí)進(jìn)行大量菌株的藥敏試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，缺點(diǎn)是不能進(jìn)行最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration， MBC)的測(cè)定。 與稀釋法藥敏試驗(yàn)有關(guān)的指標(biāo)有哪些？ MIC： 最低抑菌濃度 MBC： 最低殺菌濃度 MIC50： 抑制50%受試菌株的MIC值 MIC90： 抑制90%受試菌株的MIC值 MBC50： 殺死50%受試菌株的MBC值 MBC90： 殺死90%受試菌株的MBC值 瓊脂稀釋法 瓊脂選擇法是將藥物混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多點(diǎn)接種器接種細(xì)菌。 經(jīng)孵育后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含藥物濃度為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC ） 試驗(yàn)菌的結(jié)果報(bào)告可用MIC（ug/ml ）或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報(bào)告。 多點(diǎn)接種儀 試管稀釋法 微量稀釋法 微量稀釋法結(jié)果閱讀 E-試驗(yàn) E試驗(yàn)原理 E試條（E-test）是一條 5mm×50mm的無(wú)孔試劑載體，一 面固定有預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。 將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過(guò)夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC） E-試驗(yàn)結(jié)果閱讀 紙片擴(kuò)散法 紙片擴(kuò)散法原理 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上 紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度 在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。 紙片擴(kuò)散法結(jié)果圖 規(guī)范化的藥敏試驗(yàn)方法-擴(kuò)散法(紙片法) 原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，因此敏感細(xì)菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長(zhǎng)受到抑制，根據(jù)抑菌圈的大小即可推知該藥物的最低抑菌濃度（MIC）。 正確的接種菌量 擴(kuò)散法：0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?.5×108CFU/ml） 菌苔厚度的要求 合適的培養(yǎng)基厚度 普通細(xì)菌 MH瓊脂培養(yǎng)基（Mueller－Hinton Agar） 培養(yǎng)基厚度：4mm 肺炎鏈球菌及其他鏈球菌 5％脫纖維羊血＋MH瓊脂培養(yǎng)基 嗜血桿菌屬 嗜血桿菌培養(yǎng)基（HTM）＋SR158添加劑 4.合適的培養(yǎng)條件 需氧菌： 35℃ ±2 ℃ ，16-18小時(shí) 嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌：20-24小時(shí) 葡萄球菌：33-35 ℃ ，苯唑西林、萬(wàn)古霉素 24小時(shí) 腸球菌：萬(wàn)古霉素-24小時(shí) 溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、奈瑟氏菌屬等：20-24小時(shí) 5.正確閱讀結(jié)果（紙片法） 工具：游標(biāo)卡尺，尺子 光源：反射光、透射光 閱讀： 藥敏平皿背襯不反光的黑色背景用 肉眼觀察 也可用機(jī)器閱讀抑菌圈直徑 抑菌圈邊緣微弱生長(zhǎng)的、僅能在放大鏡下才能觀察到的細(xì)小菌落應(yīng)忽略 正確測(cè)量苯唑西林、萬(wàn)古霉素和利奈唑胺對(duì)葡萄球菌；以及萬(wàn)古霉素對(duì)腸球菌的抑菌圈直徑 結(jié)果判斷和報(bào)告：紙片擴(kuò)散法—— 1株細(xì)菌1個(gè)藥1個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 用精確度為1mm的游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。 通常采用CLSI公布的藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用三級(jí)劃分制。 臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI 是我國(guó)的部頒標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果判斷和報(bào)告 敏感（Susceptible）：當(dāng)一種細(xì)菌引起的感染，用某種藥物常規(guī)量治療有效，這種細(xì)菌即對(duì)該藥高度敏感。 中度敏感（Intermediate）：當(dāng)細(xì)菌引起的感染僅在應(yīng)用高劑量抗菌藥物時(shí)有效，或者細(xì)菌處于體內(nèi)抗菌藥物濃縮的部位或體液（如尿、膽汁、腸腔等）中時(shí)才被抑制，這種細(xì)菌對(duì)該藥僅呈中度敏感。 耐藥（Resistance）：藥物對(duì)某一細(xì)菌的藥敏高于藥物在血或體液內(nèi)可能達(dá)到的濃度時(shí)，有時(shí)細(xì)菌能產(chǎn)生滅活抗菌藥物的酶，則不論其MIC值大小如何，仍應(yīng)判定該菌為耐藥。例如產(chǎn)青霉素酶的金葡菌即應(yīng)認(rèn)為該菌對(duì)青霉素耐藥。 6.重要的質(zhì)控菌 腸桿菌科細(xì)菌：大腸埃希菌ATCC25922 非發(fā)酵菌： 銅綠假單胞菌ATCC27853 葡萄球菌： 金黃色葡萄球菌ATCC25923 腸球菌： 糞腸球菌ATCC29212 肺炎鏈球菌： 肺炎鏈球菌ATCC49619 嗜血桿菌： 流感嗜血桿菌ATCC49247 改變條件對(duì)于質(zhì)控的要求 改變條件對(duì)于質(zhì)控的要求 紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果異常分析 天然耐藥 （二）正確的抗菌藥物組合 原則：針對(duì)監(jiān)測(cè)細(xì)菌設(shè)計(jì)監(jiān)測(cè)藥物的品種和數(shù)量 CLSI抗菌藥物選擇的原則（A、B、C、U組） 根據(jù)病原菌的種類 革蘭陽(yáng)性球菌 葡萄球菌、腸球菌 、鏈球菌等 革蘭陰性桿菌 腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌等 根據(jù)本單位臨床實(shí)際需要 FDA批準(zhǔn)臨床微生物室常規(guī)藥敏試驗(yàn)分組 抗菌藥： A .為常規(guī)的一級(jí)(一線)試驗(yàn)組合并常規(guī)報(bào)告結(jié)果 B. 亦可用于一級(jí)(一線)試驗(yàn)，但應(yīng)選擇性報(bào)告，即當(dāng)A組藥物耐藥時(shí)可以選擇性地報(bào)告B組中的同類藥物 C. 為補(bǔ)充性藥物，可選擇性報(bào)告 U. 為補(bǔ)充性藥物，僅用于治療尿路感染的選擇用藥 補(bǔ)充性藥物選擇性報(bào)告的原則 對(duì)一線試驗(yàn)組合的藥物耐藥 身體特殊部位 患者不能接受一線試驗(yàn)組合的藥物 一線試驗(yàn)組合的藥物對(duì)患者無(wú)效 復(fù)數(shù)菌感染 多部位感染 沙門菌屬、志賀菌屬細(xì)菌的抗菌藥物選擇 葡萄球菌的抗菌藥物選擇 (三)監(jiān)測(cè)菌種的要求 結(jié)核分枝桿菌、真菌和厭氧菌不列入耐藥監(jiān)測(cè)范圍 需監(jiān)測(cè)的臨床分離菌必須鑒定到種 葡萄球菌必須明確 MRS：甲氧西林耐藥 MSS：甲氧西林敏感 大腸埃希菌、克雷伯菌和奇異變形桿菌應(yīng)明確 是否產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）？ 肺炎鏈球菌必須明確對(duì)青霉素的耐藥屬性 PRSP：青霉素耐藥 PISP：青霉素中度敏感 PSSP：青霉素敏感 Thank You！ItY紅軟基地

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