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SiRNA與RNAi實驗技術 RNAi的研究史 1990年，Jorgenson 在矮牽�；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默。 1995年，Guo 注入反義RNA及正義鏈RNA都能抑制線蟲par-I基因的表達。 1998年，F(xiàn)ire 和 Mello 研究證實在正義RNA阻斷基因表達實驗中，真正起作用的是雙鏈RNA，于是提出了RNAi。（2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎） 2001年，Elbashir 等在《Nature》上首次報道通過21nt的siRNA成功地在哺乳動物培養(yǎng)細胞中誘導特異性基因沉默。 RNAi的研究史 RNAi的發(fā)現(xiàn)費爾和梅羅以前一直從事線蟲基因表達的調(diào)控研究，他們將一種編碼肌肉蛋白的mRNA注射到線蟲體內(nèi)以改變線蟲的行為。 他們使用的攜帶遺傳密碼的mRNA有兩種:一種是編碼的mRNA，稱為正義RNA，另一種RNA可以與上述的mRNA堿基互補相結合， 稱為反義RNA。 無論是那一種RNA都不能夠引起預期的表型作用，但是當他們把這兩種RNA一起注射，觀察到線蟲表現(xiàn)出特有的顫搐性運動，而相似的運動只發(fā)生在那些完全缺失這種肌肉蛋白功能基因的線蟲身上，這是什么原因? RNAi的發(fā)現(xiàn)是否特異的雙鏈RNA分子可以使與其具有相同編碼的基因沉寂或者說使它的活性受到抑制? 為了檢測這個假設，他們向線蟲體內(nèi)注射了一些含有各種蛋白質(zhì)基因編碼的雙鏈RNA分子，無一例外，只要注射了含有編碼某種特異蛋白質(zhì)基因的雙鏈RNA分子，這種蛋白就不會再產(chǎn)生了。 費爾和梅羅把這個現(xiàn)象稱作RNA干擾(RNAinterference， RNAi)，認為這是一個催化過程，即微量的雙鏈RNA足可以達到抑制基因的效應。 RNAi的發(fā)現(xiàn)費爾和梅羅的研究結果發(fā)表在1998年2月19日出版的《自然》雜志上。他們的發(fā)現(xiàn)使得很多以前實驗觀察中的困惑和矛盾的結果得到了解釋并且揭示了遺傳信息流的一個基本原理，同時又開辟了一個新的研究領域。 Fire A， Xu SQ， Montgomery MK， etal. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature， 1998，391:806-811. 什么是siRNA和RNAi？ siRNA（small interfering RNA），是一種小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。 這些小片段一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補結合，會導致mRNA失去功能，即不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，也就是使基因“沉默”了，雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用就被稱為RNA干預（RNA interference， RNAi ）。 RNAi的作用機制 RNAi的特征 1. RNAi屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制，迄今為止的研究認為RNAi對染色體DNA序列的復制和轉(zhuǎn)錄過程不產(chǎn)生任何影響； 2. 具有高度的序列特異性，最近將人工合成的siRNAs，轉(zhuǎn)入宿主細胞的實驗表明，即使siRNAs中只有一個堿基與靶序列錯配， 也會使干涉效應大大減弱； 3. 具有抑制基因表達的高效性，可以引起該基因缺失突變的表型；而且遠遠少于內(nèi)源mRNA數(shù)量的dsRNA就可以實現(xiàn)完全的抑制效應，即其發(fā)生過程中存在著正反饋的信號放大效應； 4. RNAi的效應可以在不同細胞間長距離傳遞和維持，而且在某些生物中(比如線蟲)具有遺傳性。 RNAi技術的應用 基因功能研究 （Gene function）基因治療 （Gene therapy） ---病毒感染引起的疾�。―iseases by virus）： 如艾滋病，肝炎等 ---腫瘤（Tumor） ---遺傳性疾�。℉ereditary disease）新藥開發(fā)（Development of new drugs） RNAi國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 RNAi最初的研究多局限于植物、線蟲和果蠅等的研究。對哺乳動物的研究則是在最近幾年，對其發(fā)生機制有了初步了解后才開始的。RNAi技術在實驗動物體內(nèi)的研究目前在國內(nèi)還鮮有報道，在國外也不多見。目前的研究多局限于細胞水平，如何將siRNA安全有效地導入動物體內(nèi)，是制約RNAi技術在實驗動物體內(nèi)應用的瓶頸之一。但RNAi誘人的應用前景仍吸引著許多科學家、研究小組、實驗室以及國際知名的生物公司投入到這放方面的研究。如何進行RNAi實驗的設計？ 設計siRNA序列 siRNA的獲得 siRNA的轉(zhuǎn)染 RNAi的效果分析 設計siRNA序列 1、 在設計RNAi實驗時，可以先在以下網(wǎng)站進行目標序列的篩選 http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 設計siRNA序列 2、siRNA序列的選取原則 (1) 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3‘端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。 (2) 將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLASTwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。 (3) 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。設計siRNA序列 3、陰性對照 一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。 設計siRNA序列 4、目前已證實的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁找到 http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49 http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/Browse Catalog.jsp?Category=Published siRNA的獲得 目前為止較為常用的方法有通過化學合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer， E. coli， RNase III)、體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產(chǎn)生siRNA。 siRNA的獲得 1、體外制備 2、體內(nèi)表達 siRNA的獲得--體外制備 a、化學合成法 許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3-4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。 最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量 siRNA進行研究。 不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素。 siRNA的獲得--體外制備 b、體外轉(zhuǎn)錄 以DNA Oligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。 最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。 不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。 siRNA的獲得--體外制備 c、用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA 其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200-1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。 最適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型。 不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療。 siRNA的獲得--體內(nèi)表達 a、 siRNA表達載體 多數(shù)的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA， shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間。 最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。 不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。 siRNA的獲得--體內(nèi)表達 b、siRNA表達框架 siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結構siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長效抑制的研究。 最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子。 不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）。 siRNA的獲得—方法小結 siRNA的轉(zhuǎn)染 1、磷酸鈣共沉淀 將氯化鈣，RNA（或DNA）和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含RNA（或DNA）且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-RNA或DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質(zhì)量，因為甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。 siRNA的轉(zhuǎn)染 2、電穿孔法 電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉(zhuǎn)導分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據(jù)認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。 siRNA的轉(zhuǎn)染 3、DEAE-葡聚糖和聚凝胺 帶正電的二乙胺基乙基纖維素（DEAE）-葡聚糖或聚凝胺多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透壓差將DNA復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時轉(zhuǎn)染。 siRNA的轉(zhuǎn)染 4、機械法 轉(zhuǎn)染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細胞質(zhì)或細胞核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導入細胞。 siRNA的轉(zhuǎn)染 5、陽離子脂質(zhì)體試劑 在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物。據(jù)稱，一個約5kb的質(zhì)粒會結合2-4個脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會被導入培養(yǎng)的細胞。現(xiàn)存對DNA轉(zhuǎn)導原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體。 siRNA的轉(zhuǎn)染為了達到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實驗過程中，需要注意以下幾點： 1、純化siRNA 2、避免RNA酶污染 3、健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復性 4、避免使用抗生素 5、選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑 6、通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件 7、通過標記siRNA來優(yōu)化實驗 RNAi的效果分析 RNAi分子水平的檢測主要通過mRNA和蛋白兩個方面進行檢測。對于mRNA，可以采用 RT-PCR、熒光定量PCR或Northern雜交等，通過信號強弱判斷目的基因的沉默效果。由于生命的執(zhí)行者是蛋白，因此還需要對蛋白水平進行檢測，可通過Western雜交，ELISA，免疫熒光等。當然RNAi最大以及最終的效果是細胞的代謝過程、生理生化系數(shù)等表型參數(shù)發(fā)生明顯的變化。 siRNA實驗成功的要點 對每個基因設計并檢查兩到四個siRNA序列選擇低GC含量的siRNA 純化體外轉(zhuǎn)錄siRNA 避免RNA酶污染健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復性避免使用抗生素選擇好的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA 通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件通過陰性對照siRNA排除非特異行影響通過標記siRNA來優(yōu)化實驗 RNA 操作時的注意事項與實驗技巧 1、操作注意事項 1）如果可能，實驗室應辟出專門RNA操作區(qū)，離心機、移液槍、試劑等均應專用。 2）操作過程中應自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套，并經(jīng)常更換，以避免將手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。 3）盡量使用一次性槍頭、離心管等塑料制品，盡量避免與其它實驗共享器具，以防止交叉污染。 4）配制溶液用的酒精、異丙醇、Trizol等應采用未開封的新品。 5）所有玻璃制品都必須在200烘烤4小時。所有舊塑料制品都必須用0.5M的NaOH處理10分鐘，并用DEPC-H2O徹底沖洗后滅菌，也可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。無法用DEPC處理的用具可以用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNA酶的活性。 RNA 操作時的注意事項與實驗技巧 2、樣本保存的注意事項 傳統(tǒng)方法是用液氮速凍，再放到超低溫冰箱中保存。 目前有些廠家開發(fā)出專門的RNA保護劑，如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和穩(wěn)定RNA作用的試劑，將采集的組織樣本等直接放入到RNAlater中，即可起到穩(wěn)定樣本中RNA的作用。無需液氮或干冰，方便安全地在室溫下保存一段時間，低溫可長期保存。 RNA 操作時的注意事項與實驗技巧 3、RNA的定量與純度 RNA通常用分光光度計定量，測量在260 nm處的吸收值（A260）。通常分光光度計A260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的，因此RNA提取結束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當濃度范圍，再用分光光度計測量。A260為1相當于RNA的濃度為40μg/ml。 為了檢測RNA的純度，可以測量A260與A280的比值，通常純RNA的A260/A280為1.8-2.0。 問題與猜想 A、 問題 在siRNA與RNAi的研究中，仍有許多的問題： 蛋白是如何與siRNA組合在一起的，如何成為活性形式？對靶RNA的剪切作用，其相關的分子機制如何，是需要特異的蛋白來剪切靶RNA，還是引導的siRNA本身即有剪切作用等。哺乳動物與人的RNAi機制是否與簡單的真核生物類似，RNAi的進化地位如何等。 問題與猜想 B、 猜想 1、 疾病治療：主要的問題還是轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的選擇，如何找到一種高效而低毒的用于人體的轉(zhuǎn)運載體是擺在所有RNAi應用面前的最大敵人。依靠免疫系統(tǒng)尋找轉(zhuǎn)運載體可能成為途徑之一，而免疫系統(tǒng)中本身可能也有RNAi參與。細胞中是否普遍存在RNAi或進行RNAi的潛力呢？細胞的凋亡機制可能也與RNAi有關。 病毒的蛋白質(zhì)復制途徑可能有多種，RNAi是否能像人們期待的那么有效？ 問題與猜想 2、如果siRNA可以永久地關閉或者刪除DNA片斷，而不僅僅 是短期的抑制它。那么動物細胞全能性受抑制的程度可能遠遠高于過去人們所想象的。干細胞的可塑性可能是由于可以產(chǎn)生特異的siRNA或其前體。干細胞通過細胞內(nèi)的RNAi機制在發(fā)育過程中關閉或開放基因的表達，從而指導著細胞的定向分化。其中的siRNA有可能來自DNA的內(nèi)含子。 3、在研究基因時，可通過短期的抑制干細胞某個基因的表達來得知其功能。OHX紅軟基地